РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 1 ПОЛУГОДИИ 2019 ГОДА
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 2018 ГОДУ
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 2017 ГОДУ
ПУБЛИКАЦИИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ВЫПОЛНЕНИЯ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 1 ПОЛУГОДИИ 2019 ГОДА
1. В первой половине 2019 года было проведено несколько серий экспериментов с целью изучения влияния иммунотерапии ингибиторами контрольных точек на противоопухолевый иммунитет. После иммуннотерапии анти-PD1 антителами на группе из 12 мышей были получены образцы хелперных, цитоксических и регуляторных T-клеток для которых проанализированы репертуары ТКР. Также было изучено влияние анти-PD1 терапии на экспрессию маркеров активации, CD69 и CD25, маркера пролиферации, Ki-67, и секрецию IFNγ каждой из этих субпопуляций. Часть опухоли забирали для иммуногистохимического анализа, при котором с использованием оптимизированной методики многоцветной покраски были окрашены CD4, CD8 T-лимфоциты и B-клетки. Аналогичные серии экспериментов на 13 и 12 мышах были проведены для анти-CTLA-4 терапии. В одной из серий экспериментов мы также анализировали T-лимфоциты из дренирующих опухоль лимфоузлов.

При анти-PD1 терапии меланомы B16F0 обнаружено увеличение относительного содержания цитотоксических (CD8+) лимфоцитов, а также влияние увеличение числа активированных (CD69+) хелперных (CD4+ FoxP3-) лимфоцитов. Эти изменения более выражены в группе мышей, у которых иммунотерапия замедлили рост опухоли (респондеры). Путем анализа репертуаров ТКР для лимфоцитов из разных частей опухоли мы показали, что доминирующие клоны CD8+ клеток распределены по опухоли крайне гетерогенно. В сочетании с увеличением числа этих клеток в результате анти-PD1 терапии позволяет предположить, что терапия стимулирует локальную внутриопухолевую пролиферацию этих клеток. Нами также проанализированы литературные данные по терапии модельного рака легкого анти-PD1 антителами. Из сырых данные РНК секвенирования CD4+ и CD8+ клеток нами были извлечены репертуары ТКР, анализ которых показал увеличение клональности цитотоксических лимфоцитов в результате терапии. В дальнейшем, повышенная клональность сохранялась в группе респондеров, но снижалась обратно для группы нон-респондеров. Однако, в наших экспериментах на меланоме B16 мы не выявили достоверного увеличения клональности в результате терапии, что может объясняться различиями в опухолевых моделях, а также тем, что основные события экспансии происходят в лимфоузлах. Для анти-CTLA4 терапии мы обнаружили влияние на соотношение клеток с активационными маркерами CD69 и CD25 среди хелперных CD4+ лимфоцитов: терапия вызвала изменение фенотипа CD69+/CD25- на CD69-/CD25+. Такое изменение может свидетельствовать об антиген-зависимой стимуляции клеток, которая в случае терапии находится на более продвинутой стадии пролиферации клеток. Это подтверждается также увеличением числа пролиферирующих Ki67+ клеток среди T-хелперов после терапии. Образцы РНК из цитотоксических, хелперных и регуляторных Т-клеток для данной серии экспериментов подготовлены для трансрикптомногосеквенирования, которое, как мы надеемся, позволит более детально установить механизм противоопухолевого иммунитета, индуцируемого анти- CTLA4 терапией.

Для серий экспериментов с анти-PD1 и анти-CTLA4 терапии подготовлены блоки фиксированной цинком опухолевой ткани. С использованием оптимизированной методики многоцветной флуоресцентной иммуногистохимии срезы опухолей окрашены на CD4/CD8/B220/DAPI и для них получены флуоресцентные изображения полных срезов, а также полные изображения параллельных срезов, окрашенных на гематоксилин и эозин. Ведется обработка и анализ полученных изображений.

2. Для идентификации, выделения и анализа репертуара опухоль- специфичных клеток нами были оптимизированы методики формирования у мышей противоопухолевого иммунитета, увеличения иммуногенности опухолевых антигенов invitro, стимуляции и выделения опухоль-специфичных лимфоцитов invitro. Для формирования у мышей устойчивого противоопухолевого иммунитета мы использовали анти-PD1 терапию, анти-CTLA4 терапию с последующей резекцией опухоли, анти-GITR терапию и введение ослабленных опухолевых клеток с повышением их иммуногенности за счет теплового шока. Для стимуляции invitro мы также использовали клетки после теплового шока вместе с внеклеточными компонентами без дополнительного лизирования и фракционирования. Кроме этого, от лаб. В.С. Косорукова (ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина») были получены 8 пептидных неоантигенов для меланомы B16, для каждого из которых мы проверили иммунный ответ CD4 и CD8 клеток с использованием минимум двух мышей, обладающих противоопухолевым иммунитетом. Для описанных и предстоящих экспериментов на протяжение первого полугодия непрерывно пополнялась группа мышей с противоопухолевым иммунитетом. Формирование и проверка противоопухолевого иммунитета у мышей занимает около 3 месяцев.

Для получения опухоль-специфичных клеток против меланомы B16 нами оптимизированы условия иммунизации мышей к этой опухоли. При этом мы сравнили разные способы стимуляции противоопухолевого иммунитета, среди которых терапия анти-PD1 антителами и тепловой шок опухлевых клеток перед введением показали наилучший результат. В экспериментах в первой половине 2019 года для идентификации опухоль-специфических клеток было использовано 10 мышей с устойчивым противоопухолевым иммунитетом и еще 24 мышей подготовлено для последующих экспериментов. Для вычисления клеток, специфичных к конкретных антигенов мы использовали пептидные неоантигены, с мутациями, имеющимися у опухоли B16. Среди 8 проанализированных пептидов 3 показали специфический ответ со стороны CD8+ клеток, а два - со стороны CD4+ клеток, предположительно регуляторных T-клеток. Запланированы эксперименты, в которых будут получены репертуары этих антиген-специфичных клеток после их выделения на основании секреции IFN???? в ответ на пептидные антигены.

3. Для выявления опухоль-специфических антител и проверки возможности их идентификации по образцам крови нами были получены образцы плазматических клеток из периферической крови, опухоли и опухоль-дренирующих лимфоузлов для шести пациентов с колоректальным раком, восьми пациентов с меланомой и трех пациентов с раком легкого. Для образцов одного пациента с колоректальным раком и трех пациентов с меланомой было проведено секвенирование и охарактеризованы репертуары B-клеточных рецепторов. С использованием образцов опухолей этих пациентов мы также оптимизировали условия получения культуры опухоль-инфильтрирующих Т лимфоцитов, их размножения и обогащения опухоль-специфичными Т клетками. При этом влияние разных параметров и процедур оценивали путем анализа числа и субпопуляционного состава лимфоцитов. Часть этих проб также была отобрана и подготовлена для анализа репертуаров ТКР.

Сравнение репертуаров иммуноглобулинов плазматических клеток из крови, опухоли и опухоль-дренирующих лимфоузлов одного пациента с колоректальным раком показало довольно низкое пересечение этих репертуаров. Доминирующие клоны из лимфоузлов и опухоли можно встретить и в крови, но по лишь из первой сотни самых представленных клонов. Сравнение клеток между разными лимфоузлами и разными областями опухоли также показал сильное отличие репертуаров. Это указывает на существенную гетерогенность плазматических клеток в опухоли и опухоль-дренирующих лимфоузлах. Пока не ясно, до какой степени их репертуар в крови отражает репертуар, усредненный по опухоли и лимфоузлам. Помимо этого, обнаружено, что через 5 дней после хирургического удаления опухоли и опухоль-дренирующих лимфоузлов, содержание опухолевых клонов плазматических клеток в крови существенно снижается, что может быть использовано для идентификации таких клонов.

4. По результатам исследования подготовлены и опубликованы 2 статьи в научных журналовбазы данных WebofScience, 2 из которых входят в первый квартиль (Q1), и 1 статья визданиях, индексируемых РИНЦ.

5. Члены творческого коллектива приняли участие в 7 международных и 5 российскихконференциях. На базе лаборатории было проведено 8 семинаров, из них 5 с очным участиемведущего ученого.

6. Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы заявки на изобретение № 2019121874 от 11 июля 2019 г. "Способ прогнозирования выживаемости у пациентов саденокарциномой легкого, несущей мутации в гене KRAS".

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 2018 ГОДУ
Раздел 1. Изучение эффектов иммунотерапии антителами к ингибиторам иммунных контрольных точек на мышиных моделях
Мы продолжили исследования механизмов иммунотерапии антителами к различным ингибиторами иммунных контрольных точек, в частности, прямого влияния терапевтических антител на различные субпопуляции опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TILs). Эти исследования проводили на модельной меланоме B16F0 у трансгенных мышей линии C57Bl/6-FoxP3egfp. В этом году мы проанализировали влияние иммунотерапии на транскриптом B-лимфоцитов, CD4, CD8 и регуляторных Т-лимфоцитов (Treg) стареющих (aCTLA-4) и молодых (aOX40) мышей, соответственно. В отличии от человеческих антител к CTLA-4 (Ипилимумаб), используемое нами антитело (клон 9D9) не обладает цитотоксической активностью в отношении Treg (что подтверждается результатами наших экспериментов), и его эффект обусловлен исключительно блокированием CTLA-4. Анализ транскриптомов TILs показал, что aCTLA-4 терапия избирательно воздействует на эффекторные CD4+ клетки, в то время как aOX40-терапия, согласно первым полученным результатам, влияет на все популяции TILs. C помощью проточной цитометрии было изучено влияние aCTLA-4 терапии молодых мышей на активность и численность TILs и клеток миелоидного ряда. Эти эксперименты подтвердили активацию и пролиферацию CD4+ эффекторных клеток, а также выявили увеличение численности опухоль-инфильтрирующих нейтрофилов в результате терапии. На основании полученных данных нами предложен механизм действия aCTLA-4 терапии.

Были также начаты исследования aGITR и aPD-1 терапии, а также их комбинации. Для aGITR терапии мы показали цитотоксическое воздействие на Тreg клетки. Мы установили, что для обеспечения выраженного эффекта aPD-1 терапии ее необходимо начинать до того, как опухоли пальпируются, то есть на 5-7 день для нашей модели. Терапевтический эффект проявляется как на быстрорастущих опухолях, так и на опухолях с замедленным ростом. Для первых aPD-1 терапия замедляет рост на 3 дня, а для вторых - вызывает элиминацию 50% медленно растущих опухолей.
Для рационализации похода к комбинированной терапии мы проанализировали накопленные данные и обнаружили увеличение доли Treg клеток среди TILs со временем, что может свидетельствовать об увеличении зависимости опухоли от этих клеток. На этом основании мы предложили комбинацию, при которой одно антитело будет замедлять рост опухоли и переводить ее в Treg-зависимое состояние, а второе будет элиминировать Тreg клетки. Для этого мы использовали комбинацию аPD-1 и аGITR, в которой первой применяли aPD-1 терапию, а после, при достижении опухолью размера 1 см начинали aGITR терапию. При такой схеме лишь у одной из 10 мышей мы наблюдали регресс опухоли в течение 8 дней, однако после этого рост возобновился, и повторная aGITR-терапия не подействовала. Изучение путей, по которым которым опухоль ускользает от иммунного надзора, в т.ч. в подобных случаях, запланировано на 2019 год.
Нами также были отсортированы отдельные субпопуляции TILs для анализа влияния aCTLA-4 и aGITR терапии на их транскриптом у молодых животных.

Раздел 2. Получение популяций опухоль-специфичных Т-лимфоцитов с использованием экспериментальных мышиных моделей
Для получения опухоль-специфичных T-лимфоцитов, мы использовали два подхода, основанных на их стимуляции in vivo и in vitro.
При стимуляции in vivo мы использовали отработанную ранее методику сортировки живых активированных Т-лимфоцитов на основании секреции ими γ-интерферона (IFNγ). Мы предполагаем, что фракция активированных IFNγ+ клеток в опухоли существенно обогащена опухоль-специфичными клетками. На линейной опухолевой модели у разных мышей репертуар Т-клеточных рецепторов (ТКР) этих клеток должен существенно перекрываться, и, набрав достаточную статистику, можно будет вычислить эти общие опухоль-специфичные варианты ТКР. Для этого нами собраны образы IFNγ+ и IFNγ- клеток отдельно для CD4+/FoxP3- и для CD8+ популяций TILs на группе из 30 мышей. Для этих образцов получены таргетные кДНК библиотеки и массированным секвенированием проанализированы репертуары T-клеточных рецепторов. Ведется биоинформатический анализ данных с целью выявления консенсусных вариантов характерных для опухоль-специфичных Т лимфоцитов.
Для стимуляции опухоль-специфичных клеток нами оптимизирована методика получения дендритных клеток (DC) из костного мозга, которая позволяет получить 80% DC на 7 день культивирования. В качестве источника опухолевых антигенов мы использовали опухолевый лизат, стандартная процедура приготовления которого была дополнена тепловым шоком и сбором секретируемых микровезикул, для увеличения иммуногенности антигенов. Поиск опухоль-специфичных клеток в этой системе проводили среди T-лимфоцитов из селезенок мышей с устойчивым иммунитетом к опухоли B16F0. Эти мыши были получены в результате терапии aPD-1 антителами. Для увеличения содержания опухоль-специфичных клеток мы дополнительно иммунизировали мышей клетками B16F0 за 4 дня до взятия селезенок. В результате нам удалось достоверно зарегистрировать опухоль-специфичные клетки среди CD4+ лимфоцитов, число которых составило 1% от всех CD4+ клеток. Однако неспецифическая активация при текущем протоколе составляет 2%, для получения чистой популяции опухоль-специфичных Т клеток в 2019 году мы планируем снизить этот процент до 0.2% или ниже.

Раздел 3. Исследование эффектов иммунотерапии опухолей на мышиных моделях старения
В прошлом году мы отсортировали TILs (B-лимфоциты, CD4, CD8 и регуляторные Т-лимфоциты) после aCTLA-4 иммунотерапии для стареющих мышей, в то время как кривые роста опухолей измеряли на молодых мышах. В этом году мы отсеквенировали и проанализировали транскриптомы отсортированных ранее TILs, а также собрали аналогичный материал для молодых мышей и измерили влияние aCTLA-4 на кривые роста опухолей у стареющих животных. aCTLA-4 терапия замедляла рост опухолей у стареющих мышей примерно в той же степени, как и у молодых мышей, и влияние на относительное количество субпопуляций TILs тоже существенно не отличалось (в обоих случаях наблюдалось небольшое увеличение эффекторных CD4+ клеток).
Другой задачей, которая позволяет понять влияние старения на эффект иммунотерапии, была отработка модели парных опухолей меланомы B16F0 у мышей C57Bl/6 и колоректального рака CT26 у мышей BALB/c. Эти эксперименты показали, что парные опухоли у стареющих мышей растут еще более гетерогенно, чем у молодых, что вероятно обусловлено накоплением отличий (в т.ч. иммунной системы) между мышами с возрастом. На фоне гетерогенности нам не удалось выявить эффект иммунотерапии для это модели. В тоже время опухоли CT26 у стареющих BALB/c мышей продемонстрировали существенно более однородный рост, что делает данную опухолевую модель предпочтительной при изучении иммунотерапии на моделях старения и позволяет использовать модель парных опухолей, которая позволяет анализировать репертуар до и после терапии и классифицировать мышей на тех, которые ответили на терапию и нет, даже после забора одного опухолевого узла.

Раздел 4. Продолжение набора образцов опухолей и крови пациентов для изучения клональности репертуаров ТКР. Получение библиотек ТКР
Совместно с ФБУЗ «Приволжский окружной медицинский центр» ФМБА России в 2018 году был продолжен набор образцов плазмы крови, белых клеток крови, и опухолевых тканей для выделения ДНК и получения репертуаров ТКР. Анализ собранных ранее образцов показал, что репертуары ТКР в крови и опухоли отличаются практически полность, а сводобной циркулирующей ДНК не достаточно для получения репертуара ТКР опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов. Для увеличения свободной ДНК TILs в этом году кровь (45 мл) забирали через 2-4 часа после разрушения метастазов сфокусированным ультразвуковым либо СВЧ воздействием. Мы показали, то в этих условиях концентрация свободной ДНК возрастает более чем в 10 раз. Также мы готовили парафиновые блоки опухолевой ткани, которые будут использованы для выделения ДНК и анализа репертуара TILs непосредственно в опухоли. Всего по модифицированному протоколу был собран материал для 6 пациентов.
В сотрудничестве с К.К Лактионовым (НМИЦ онкологии им Н.Н. Блохина) и В.Е. Загайновым (ФБУЗ ПОМЦ ФМБА) нами были отработаны протоколы забора и выделения живых лимфоцитов из аденокарциномы легкого и колоректального рака. Для ряда образцов были отсортированы плазматические клетки, с помощью которых мы планируем установить степень пересечения репертуара иммуноглобулинов плазматических клеток в крови, лимфоузлах и опухоли. При их существенном пересечении процедура получения данных о репертуаре опухоль-инфильтрирующих плазматических клеток может быть радикально упрощена. Эти методики будут использованы в 2019 году для анализа репертуаров плазматических клеток, а также для выделения узких субпопуляций T-лимфоцитов с целью их культивирования, идентификации и обогащения опухоль-специфичными клетками.

Раздел 5. Размножение и поддержание мышей разных линий (С57BL/6, BALB/c, C57BL/6 FoxP3-EGFP), в том числе ведение группы стареющих животных. Ведение культур опухолевых клеток, наработка необходимого количества клеточного материала для получения опухолевых моделей
Для целей проекта лабораторных животных размножали и содержали в виварии Приволжского исследовательского медицинского университета (ПИМУ). В 2018 году в экспериментах было задействовано более 260 мышей, большая часть из которых это трансгенные мыши линии C57BL/6-FoxP3egfp, у которых регуляторные Т-клетки экспрессируют флуоресцентную химеру FoxP3-EGFP. Этот ген расположен на X-хромосоме и нами была налажена нетравматичная и надежная методика идентификации гомо- и гетерозиготных по этому гену самок с помощью ПЦР. Помимо трансгенных мышей нами также поддерживались и размножались линии мышей C57BL/6 и Balb/c дикого типа. Также для экспериментов нами было подготовлено и использовано в экспериментах две группы стареющих мышей линий C57BL/6-FoxP3egfp и Balb/c, часть из которых оставлено для экспериментов в 2019 году. На начало 2019 года в виварии НИИ ЭОиБМТ для экспериментов подготовлено 100 трансгенных мышей, 70 мышей C57BL/6 и 100 мышей Balb/c, C57BL/6-FoxP3egfp, а также 17 свежих гнезд для размножения трансгенных мышей.

Раздел 6. Отработка методики иммуногистохимического анализа распределения субпопуляций опухоль-инфильтрирующих Т-лимфоцитов в срезах опухолей
Нами было протестировано 15 антител на предмет возможности их использования для иммуногистохимического анализа наших образцов. 13 из них позволили получить специфическое окрашивание препаратов. Нами был оптимизирован протокол многоцветной флуоресцентной иммуногистохимии с использованием тираминовой амплификацией сигнала, который позволил нам анализировать одновременно распределение трех антигенов и ядер (DAPI). В 2019 году мы планируем повысить надежность данного протокола путем снижения фоновой автофлуоресценции за счет ее тушения и использования альтернативных способов фиксации. Кроме этого нами была разработана процедура сканирования и склейки полноразмерных изображений срезов на разных длинах волн (возбуждения и эмиссии) с их последующем наложением с погрешностью не более 2 пикселей. Это позволит нам повторно анализировать весь материал и проверять на нем всевозможные закономерности. Нами начат набор полноразмерных флуоресцентных изображений срезов опухолей после aCTLA-4 терапии для проверки предложенного нами механизма этой терапии.

Раздел 7. Подготовка к публикации статей по результатам проведенной работы.
По результатам исследования подготовлены и опубликованы 4 статьи научных журналов базы данных Web of Science, 2 из которых входят в первый квартиль (Q1), и 2 статьи в изданиях, индексируемых РИНЦ.

Раздел 8. Оснащение лаборатории оборудованием, материалами и комплектующими для проведения исследований.
С целью выполнения заявленных исследований за счет бюджетных средств гранта проведена закупка оборудования на общую сумму 2 081 520,03 рублей и комплектующих и расходных материалов на общую сумму 12 604 449,13 рублей: 1. ДНК-амплификатор CFX96 Touch Real Time System, Bio-Rad для проведения ПЦР-анализа и рабочая станция для анализа данных; 2 система автоматической компенсации дисперсии модели Deepsee UPG HP для титан-сапфирового фемтосекундного лазера MAI TAI AX HP необходимая для увеличения глубины визуализации при иммунофлуоресцентном анализе гистологических препаратов; 3. Моторизованный предметный столик для микроскопа Leica DM2500 с программным обеспечением для пошаговой съемки необходимый для съемки гистологических препаратов; 4. химические реактивы для проведения секвенирования и сортировки клеточных культур и иммуногистохимических исследований; 5. культуральные среды и добавки для приготовления культур опухолевых клеток; 6. культуральный пластик для наращивания культуры опухолевых клеток; 7. хирургические инструменты для проведения манипуляций с лабораторными животными.
Для выполнения запланированных исследований за счет внебюджетных средств гранта было приобретено следующее оборудование на общую сумму 763 167,89 руб. и расходные материалы на общую сумму 2 100 008,24 руб.: 1. стационарный рН-метр Ohaus ST2100-E для определения pH растворов, используемых при проведении исследований; 2. прецизионные весы Ohaus PA213C для взвешивания необходимых для проведения исследования химических реактивов; 3. жидкостной термостат BioSan WB-4MS для создания и контроля температурных условий при нагреве и охлаждении химических реактивов; 4. оптический стол 1HB08-15-07 с опорами для компенсации вибраций при установки высокоточного лабораторного оборудования необходимого при проведении исследования; 5. химические реактивы для проведения сортировки клеточных культур и иммуногистохимических исследований; 6. культуральные среды и добавки для приготовления культур опухолевых клеток; 7. культуральный пластик для наращивания культуры опухолевых клеток; 8. анестезирующие средства для проведения хирургических манипуляций с лабораторными животными.

Раздел 9. Участие ведущего ученого и членов научного коллектива в конференциях, научных семинарах, симпозиумах.
Члены творческого коллектива приняли участие в 11 международных и 9 российских конференциях.
На базе лаборатории было организовано 4 семинара с приглашенными докладчиками:
1. 8 февраля - Миличко В.А., к.ф.-м.н., научный сотрудник физико-технического факультета, сотрудник международного научно-исследовательского центра нанофотоники и метаматериалов Университета ИТМО, «Нелинейно-оптические металорганические монокристаллы»
2. 17 апреля - Тучин В.В., д.ф.-м.н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, Заведующий кафедрой оптики Саратовского национального исследовательского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского, «Оптическое просветление биологических тканей: механизмы и приложения в оптической визуализации»
3. 23 марта – Щеславский В.И., представитель фирмы Becker&Hickl, Германия, «Триплетные состояния в генетически кодируемых белках: возможности для имиджинга»
4. 9 июля - Дмитриев Р.И., к.х.н., starting Investigator, Metabolic Imaging Group, University College Cork, Ireland, ведущий научный сотрудник Института регенеративной медицины Сеченовского Университета, «Multi-parametric FLIM-PLIM microscopy of 3D tissuemodels»

Раздел 10. Обеспечение функционирования лаборатории, диагностика оборудования
Была проведена диагностика неисправностей конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 880 Carl Zeiss, переданного организацией лаборатории в 2018 году для проведения иммунофлуоресцентного анализа гистологических препаратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ ПО ПРОЕКТУ В 2017 ГОДУ
1. Исследование клональной структуры репертуаров опухоль-инфильтрирующих Т- и B-лимфоцитов при кожной меланоме человека
Проведено исследование клональной структуры репертуаров опухоль-инфильтрирующих Т- и B-лимфоцитов при кожной меланоме человека. Репертуары гипервариабельных (CDR3) фрагментов Т-клеточных рецепторов и антител экстрагированы из данных транскриптомного анализа TCGA (48+48 нт RNA-Seq) опухолей для 458 пациентов (human skin cutaneous melanoma, SKCM). Показано, что высокий уровень экспрессии иммуноглобулинов опухоль-инфильтрирующими В-лимфоцитами, высокий уровень клональности репертуаров тяжелых цепей таких иммуноглобулинов, а также высокая пропорция транскриптов изотипа IgG1 от всех транскриптов IGH в опухоли ассоциировались с большей продолжительностью жизни пациентов. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Biotechnology.

2. Сбор и молекулярное тестирование образцов высокодифференцированных опухолей щитовидной железы
В рамках исследования оценки эффективности иммунодиагностических методов в онкологии начата работа по сбору и молекулярному тестированию образцов высокодифференцированных опухолей щитовидной железы. В исследование включены 25 пациентов с опухолями щитовидной железы промежуточного риска. Проведен первый этап работы, включающий в себя сбор и первичную оценку собранного опухолевого материала. Работа будет направлена на сравнительную оценку информативности двух методов дифференциальной диагностики опухолей щитовидной железы промежуточного риска, а именно молекулярного профилирования опухолевой ткани и иммунодиагностического профилирования сыворотки крови.

3. Создание банка образцов опухолей и крови пациентов для изучения клональности репертуаров ТКР
На образцах пациентов с раком толстого кишечника и мочевого пузыря отработаны ключевые методики для дальнейшей работы с материалом, получаемым от пациентов, в том числе: получение и сортировка субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови, получение и сортировка субпопуляций опухоль-инфильтрирующих Т лимфоцитов, забор образцов опухолей и метастазов для консервации ДНК, РНК и получения парафиновых блоков, выделение свободно циркулирующей ДНК крови. Собраны образцы для первых пациентов, планируется дальнейшая работа. Исследование направлено на определение клональной структуры для сортированных субпопуляций Т-лимфоцитов в опухоли и периферической крови пациентов с дополнительным молекулярно-генетическим и морфологическим анализом образцов опухоли.

4. Размножение и поддержание мышей разных линий (C57Bl/6, BALB/c, C57Bl/6-FoxP3-EGFP), в том числе ведение группы стареющих животных
Размножены и поддерживаются в достаточной для работы численности колонии мышей C57Bl/6, BALB/c, трансгенных мышей C57Bl/6-FoxP3-EGFP, особи которых были получены от проф. Александра Руденского. Регуляторные Т-клетки этой линии экпрессируют зеленый флуоресцентный белок EGFP, что позволяет сортировать эти клетки в интактном виде (без использования внутриклеточного окрашивания), что необходимо для получения качественной РНК. Всего в 2017 году в экспериментах было задействовано около 200 мышей, в том числе около 40 стареющих животных в возрасте более 1 года. Более 200 мышей подготовлено к экспериментам в первой половине 2018 года. Для минимизации вклада случайного генетического разнообразия каждая серия экспериментов проводится на близкородственных мышах, потомках одних родителей во втором поколении. Разработан протокол быстрого фенотипирования трансгенных FoxP3-EGFP мышей с помощью проточной цитометрии.

5. Разработка схем иммунотерапии антителами к ингибиторам контрольных иммунных точек
Протестированы различные схемы подкожного прививания опухолевых клеток лини B16F0, иммунотерапии и забора опухолевой ткани. Выбрана оптимальная схема, при которой прививается 1 миллион клеток B16F0, опухоли растут на протяжении 8-9 дней (до 1-2 мм). Иммунотерапия проводится в течение 5 дней (схема зависит от выбранного моноклонального терапевтического антитела). Резекция осуществляется на 15-16ый день при достижении размера опухоли 8-9 мм. При такой схеме достигается высокий процент приживаемости опухолей, эффективный отбор для иммунотерапии мышей, достоверно несущих опухоль, забор опухоли достаточного размера (содержащей порядка 2-4 тысяч регуляторных Т-лимфоцитов - малочисленной, лимитирующей эксперименты популяцией). Более того, опухоль не превышает критической массы, после которой возникают некротические очаги, и возрастает гетерогенность по структуре. Также отработана схема с двумя прививаемыми опухолями для изучения эффектов в формате «до» и «после» иммунотерапии на одних и тех же особях. Схема является рабочей, однако, требует большого расхода мышей и реактивов вследствие меньшей стабильности. Тем не менее, данная схема может быть использована на более поздних этапах работы.

6. Оптимизация выделения опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов
Опробованы различные подходы к выделению опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов, в том числе выделение с использованием позитивной селекции Т-клеток на магнитных частицах (CD45/CD90.2, Miltenyi), перколле либо градиенте перколла, или их сочетании. От выделения на перколле при рутинной работе с опухолевыми образцами мышей решено отказаться по причине потери фракции, обогащенной крупными, активированными Т-лимфоцитами, представляющими существенный интерес. Выбрана наиболее надежная и прямая схема выделения опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов: гомогенизация опухолевых тканей, инкубация в присутствие смеси ферментов Liberase TL и ДНКазы I, промывка, фильтрация через сито с ячейками 70 мкм, покраска антителами и сортировка на приборе FACSAriaIII. Тем не менее, протокол на основе градиентного центрифугирования в растворе перколла использовался на этапе работы с крупными некротическими мышиными опухолями и с образцами человеческих опухолей, для которых характерно исходно высокое содержание клеточных обломков и прочего "мусора".
Введена в строй модернизированная версия сортера FACSAria III, оснащенного всеми необходимыми лазерами, что заметно повысило качество и надежность работы. Проведены первые серии экспериментов с сортировкой CD8, CD4, Treg Т-лимфоцитов, а также B-лимфоцитов из B16F0 опухолей мышей, пролеченных и не пролеченных моноклональным терапевтическим антителом к CTLA-4. Ведется работа с набранным материалом РНК.
Показано, что репертуары Т-клеточных рецепторов, извлекаемые из данных транскриптомного анализа для сортированных популяций Т-лимфоцитов высоко-информативны и сопоставимы с поверхностным анализом репертуара с использованием таргетного секвенирования. Результаты работы опубликованы в журнале Nature Biotechnology. В связи с этим подход RNA-Seq сортированных Т- и В-лимфоцитов рассматривается как альтернатива таргетному секвенированию репертуаров ТКР и антител, позволяющая как извлекать репертуары иммунных рецепторов, так и проводить сравнительный транскриптомный анализ популяций.

7. Использование EGFP как суррогатного антигена опухоли
Получены стабильно трансфицированные EGFP клетки линии CT26, проведенные через единичные клетки. Полученные моноклональные линии отличались высокой гомогенностью и стабильностью экспрессии EGFP и были задействованы для отработки модели, в которой EGFP используется как суррогатный антиген опухоли, и сортировка EGFP-специфичных Т-лимфоцитов проводится с помощью тетрамеров MHC, несущих наиболее иммуногенный пептид EGFP. После ряда безуспешных попыток детектировать EGFP-специфичные Т-лимфоциты в опухоли или селезенке мышей, несущих EGFP-содержащую опухоль, от данной модели было решено отказаться.

8. Отработка техники идентификации опухоль-специфичных Т-лимфоцитов
Успешно отработана схема сортировки живых, продуцирующих интерферон-гамма Т-лимфоцитов из опухоли, с использованием достаточно сложного в применении подхода – secretion assay. Получены образцы первой серии экспериментов. С использованием этого и ряда других подходов, мы планируем сформировать системную базу данных о спектре вариантов Т-клеточных рецепторов C57Bl/6, специфичных к меланоме B16F0. Такие данные будут высоко востребованы научным сообществом для самых различных исследований на модели B16F0, а также помогут нам в нашей работе отслеживать судьбу опухоль-специфичных CD4 и CD8 (а по возможности также Treg) Т лимфоцитов при иммунотерапии.

9. Подготовка к публикации статьи по результатам проведенной работы
По результатам анализа полученных данных опубликована статья, входящая в первый квартиль (Q1) научных журналов базы данных Web of Science:
Bolotin D.A., Poslavsky S., Davydov A.N., Frenkel F.E., Fanchi L., Zolotareva O.I., Hemmers S., Putintseva E.V., Obraztsova A.S., Shugay M., Ataullakhanov R.I., Rudensky A.Y., Schumacher T.N., Chudakov D.M. Antigen receptor repertoire profiling from RNA-seqdata. Nature Biotechnology. 2017 Oct 11; 35(10) :908-911. doi: 10.1038/nbt.3979 (IF 42)

10. Оснащение лаборатории оборудованием, материалами и комплектующими для проведения исследований
С целью выполнения заявленных исследований за счет бюджетных средств гранта проведена закупка комплектующих, расходные материалы и лабораторные животные на общую сумму 16 300 934, 44 руб.: 1. источник лазерного излучения с длиной волны 405 нм к системе для сортировки клеток BD FACSAriaIII необходимый для выполнения задач по сортировке культур клеток; 2. химические реактивы для проведения сортировки клеточных культур и иммуногистохимических исследований; 3. культуральные среды и добавки для приготовления культур опухолевых клеток; 4. культуральный пластик для наращивания культуры опухолевых клеток; 5. линейные мыши для проведения экспериментов. За счет средств статьи «Прочие расходы, непосредственно связанные с проведением научного исследования» был приобретен источник бесперебойного питания необходимый для обеспечения стабильной работы системы сортировки клеток BD FACSAriaIII.
Для выполнения запланированных исследований за счет внебюджетных средств гранта было приобретено следующее оборудование на общую сумму 441 075 руб. и расходные материалы на общую сумму 773 137,17 руб.: 1. автоматический гомогенизатор тканей gentleMACS необходимый для автоматизации пробоподготовки при работе с тканями и получения суспензий отдельных клеток и тонких гомогенатов; 2. магнитный сепаратор MidiMACS необходимый для выделения исследуемого типа клеток из тканей и крови; 2. химические реактивы для проведения сортировки клеточных культур и иммуногистохимических исследований; 3. культуральные среды и добавки для приготовления культур опухолевых клеток; 4. культуральный пластик для наращивания культуры опухолевых клеток; 5. линейные мыши для проведения экспериментов.

11. Участие ведущего ученого и членов научного коллектива в конференциях, научных семинарах, симпозиумах
Члены творческого коллектива приняли участие в 4 международных и 2 российских конференциях. На базе лаборатории было проведено 10 семинаров, из них 10 с очным участием ведущего ученого.

12. Текущий ремонт лаборатории
Выполнен ремонт помещения для установки системы сортировки клеток BD FACSAria III (США) и рабочей станции к ней и проведения экспериментальных работ по сортингу культур клеток. Помещение было выделено НижГМА для Научной лаборатории геномики адаптивного противоопухолевого иммунитета Распоряжением ректора №74 от 25.11.2016 и находится по адресу: г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, д. 1, учебный корпус № 3, НИИ Биомедицинских технологий, цокольный этаж, ком. № 7.
Проведено техническое обслуживание и ремонт необходимого для проведения научного исследования оборудования, переданного организацией лаборатории.

Раздел 13. Получение образцов сортированных субпопуляций Т-лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии (на базе сторонней организации – ННГУ)
В рамках выполнения научного исследования был заключен договор с Федеральным государственным автономным образовательным учреждением высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (ННГУ им. Н.И. Лобачевского) и выполнена научно-исследовательская работа на тему «Получение образцов сортированных субпопуляций Т-лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии». Результаты представлены в приложении 1 Отчета ВУ.
ПУБЛИКАЦИИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ВЫПОЛНЕНИЯ НАУЧНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Bolotin D.A., Poslavsky S., Davydov A.N., Frenkel F.E., Fanchi L., Zolotareva O.I., Hemmers S., Putintseva E.V., Obraztsova A.S., Shugay M., Ataullakhanov R.I., Rudensky A.Y., Schumacher T.N., Chudakov D.M. Antigen receptor repertoire profiling from RNA-seqdata. Nature Biotechnology. 2017 Oct 11; 35(10) :908-911. doi: 10.1038/nbt.3979 (IF 43.271) (Q1)

2. Izraelson M., Nakonechnaya T.O., Moltedo B., Egorov E.S., Kasatskaya S.A., Putintseva E.V., Mamedov I.Z., Staroverov D.B., Shemiakina I.I., Zakharova M.Y., Davydov A.N., Bolotin D.A., Shugay M., Chudakov D.M., Rudensky A.Y., BritanovaO.V. Comparative analysis of murine T-cell receptor repertoires. Immunology. 2018 Feb; 153(2):133-144. doi: 10.1111/imm.12857. (IF 3.358) (WoS)

3. Fan X., Moltedo B., Mendoza A., Davydov A.N., Faire M.B., Mazutis L., Sharma R., Pe'er D., Chudakov D.M., Rudensky A.Y. CD49b defines functionally mature Treg cells that survey skin and vascular tissues. Journal of experimental medicine. 2018 Nov 5;215(11):2796-2814. doi: 10.1084/jem.20181442. (IF 10.79) (Q1)

4. Bolotin D.A., Poslavsky S., Davydov A.N., Chudakov D.M. Reply to "Evaluation of immune repertoire inference methods from RNA-seq data". Nature biotechnology. 2018 Nov 9;36(11):1035-1036. doi: 10.1038/nbt.4296. (IF 43.271) (Q1)

5. Druzhkova I., Ignatova N., Prodanets N., Kiselev N., Zhukov I., Shirmanova M., Zagainov V., Zagaynova E. E-Cadherin in Colorectal Cancer: Relation to Chemosensitivity. Clinical colorectal cancer. 2018 Oct 16. pii: S1533-0028(17)30495-4. doi: 10.1016/j.clcc.2018.10.003. [Epub ahead of print] (IF 3.861) (WoS)

6. Барбашова Л. Н., Южакова Д. В., Шаронов Г. В., Чудаков Д. М. Анти-CTLA-4 иммунотерапия меланомы B16 у трансгенных мышей FoxP3EGFP. Материалы докладов: XXIII Нижегородская сессия молодых ученых (технические, естественные, математические науки). май 2018. c. 104-105 (РИНЦ)

7. Барбашова Л.Н., Южакова Д.В., Клементьева Н.В. Влияние иммунотерапии мышиной меланомы В16 антителами против CTLA-4 на состав и свойства опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов. Сборник тезисов Научной Сессии молодых учёных и студентов «Медицинские этюды». март 2018. c. 300-301 (РИНЦ)

8. Weber J., de la Rosa J., Grove C.S., Schick M., Rad L., Baranov O., Strong A., Pfaus A., Friedrich M.J., Engleitner T., Lersch R., Öllinger R., Grau M., Menendez I.G., Martella M., Kohlhofer U.,Banerjee R., Turchaninova M.A., Scherger A., Hoffman G.J., Hess J., Kuhn L.B., Ammon T., Kim J.,Schneider G., Unger K., Zimber-Strobl U., Heikenwälder M., Schmidt-Supprian M., Yang F., Saur D.,Liu P., Steiger K., Chudakov D.M., Lenz G., Quintanilla-Martinez L., Keller U., Vassiliou G.,Cadiñanos J., Bradley A., Rad R. PiggyBac transposon tools for recessive screening identify B-celllymphoma drivers in mice. Nature Communications. 2019 Mar 29;10(1):1415. doi: 10.1038/s41467-019-09180-3. (Q1) (IF 13.8)

9. Pogorelyy M.V., Minervina A.A., Shugay M., Chudakov D.M., Lebedev Y.B., Mora T., Walczak A.M. Detecting T cell receptors involved in immune responses from single repertoire snapshots.PLOS Biology. 2019 Jun 13;17(6):e3000314. doi: 10.1371/journal.pbio.3000314. (Q1) (IF 8.4)

10. Изосимова А.В., Южакова Д.В., Барбашова Л.Н., Шаронов Г.В., Чудаков Д.М. Получение и идентификация опухоль-специфичныхТ-лимфоцитову мышей C57BL6 против меланомы B16F0. Сборник тезисов V Всероссийской конференции молодых ученых и студентов смеждународным участием. 2019. С. 446 (РИНЦ)
Контакты
г. Нижний Новгород, ул. Медицинская, 1
Тел.: +7 (831) 465-56-72
Почта: niibmt@pimunn.ru